实验室操作规程手册毛滴虫联合药敏试 [复制链接]

四、毛滴虫联合药敏试验

鸽毛滴虫病是由鞭毛虫禽毛滴虫（Trichomonasgallinae）引起的，是危害鸽子最重要的疾病之一，给世界养鸽业造成了严重的经济损失。

鸽毛滴虫通常寄生于各种鸟类上消化道导致黏膜炎症、溃疡，甚至因肉芽肿阻塞食道而造成宿主饥饿死亡。随着化学药物的使用，药物残留、药物毒副作用及耐药株的产生等问题不断出现，筛选具有抗鸽毛滴虫活性的新型低毒药物来减少或替代合成药物的使用成为研究热点之一。因毛滴虫也在不断进化中，对毛滴虫进行联合药敏试验，对兽医临床用药指导意义。

1、实验材料

具有毛滴虫典型症状的病鸽、毛滴虫选择HF培养基

图13鸽毛滴虫病病理变化及口腔涂片

A：口腔；B：嗉囊；C：肝脏；D：口腔涂片

2、毛滴虫的分离、鉴定及体外培养

2.1分离与鉴定

病料挑选毛滴虫的病鸽，采样步骤如下：

（1）用无菌棉拭子口腔采样后置于2ml灭菌EP管中，封闭保温带回实验室；

（2）含有样品的EP管中加入1mlHF培养基（含IU/mL的青霉素、IU/mL链霉素和10%FBS），37℃温箱静置培养24h；

（3）培养24h后混匀培养物，室温下取一滴制成压滴标本，用光学显微镜观察，发现梨形、椭圆形或圆形，顶端带有3根鞭毛，尾部带有1根鞭毛，一侧有波动膜并不断活动虫体便可初步确定为鸽毛滴虫。

2.2毛滴虫的纯化、培养

自确诊为鸽毛滴虫的样品中选择虫体活性状态好、数量多且细菌、真菌数量少的样品进行传代培养，48h传代一次，同时培养基中加入两性霉素B多次传代以纯化虫体。每隔48h传代一次，稳定传代后用于试验，可无限传代。

鸽毛滴虫在、HF及肝浸汤培养基中均能生长，但在中培养的虫体繁殖速度及活性状态均不如在HF及肝浸汤培养基中的虫体，而肝浸汤培养基虽然满足鸽毛滴虫生长的营养需求，但制备复杂且易产生肝杂质，不利于后期虫体的观察、纯化；37℃静置培养即可使虫体良好生长；培养基PH值在5.8～7.4之间虫体能正常繁殖，故此，本试验选择用PH7.2的HF培养基在37。C温箱中静置培养鸽毛滴虫。

2.3鸽毛滴虫计数

计数：无菌枪头将培养液轻轻吹打均匀，吸取一定悬液与等体积

0.4%的台盼蓝混合，然后取10μL滴于已加盖玻片的血球计数板上，计数活虫体数量（若虫体密度过大，则用预热的HF培养基稀释后再进行计数）。

虫体死活的判断标准：活鸽毛滴虫呈无色透明状，虫体运动，鞭毛或波动膜不停波动；死亡鸽毛滴虫被染成明显的蓝色，虫体变圆、结构模糊、虫体内颗粒化、失去原有的透明度、鞭毛/波动膜停止运动、甚至破裂。

虫体密度＝（4大格虫体总数/4）××稀释倍数（个/mL）。

细胞活力＝活虫体个数/（活虫体个数＋死亡虫体个数）×%。

2.3毛滴虫悬液制备

(1)接种适量鸽毛滴虫于lmLHF培养基中，37℃，静置培养24h；

(2)收集上述培养物，室温下，rpm/min离心lOmin，弃上清液，然后用1×PBS洗涤虫体：加lmL1×PBS悬浮沉淀虫体，rpm／min离心10min，弃上清液，重复2次，最后用培养基重悬；

(3)染色：取适当虫液，与等体积0.4％台盼蓝染液混匀，染色2min；

(4)计数：在3min内分别计数虫体总数和活虫体数，细胞活力99％方可用于试验；

(5)根据活虫体数量调整成一定密度的悬液，37℃放置备用。

3、体外药敏试验

根据预实验，药敏试验药物浓度设为0.、O.25、0.5、1、

2、4、8、16mg／mL，操作步骤如下：

(1)取药物原液32μL，用HF培养基进行倍比稀释。

(2)依照毛滴虫悬液制备密度为1.78x个／mL的活虫体悬液；

(3)将μL虫液与32μL药物混匀，加入96孔细胞培养板中，同时设PBS代替药物作为对照组，每个浓度重复4个；

(4)将鸽毛滴虫置于37℃温箱中培养，分别于3、6、12、24、48h用倒置显微镜观察虫体状态，并用无菌枪头将培养液轻轻吹打均匀，吸取一定悬液计数活虫体数量；

(5)计算药物对鸽毛滴虫的相对抑制率，及作用48h各药物对虫体的半数致死浓度(IC50)，

相对存活率(％)=(试验组活虫体数量／对照组活虫体数量)×％

相对抑制率(％)=％一相对存活率（％）；

(6)为确保结果准确，虫体全部死亡的组，培养孔剩余部分正常转种，继续培养24h，确定无活虫体，方可判定该浓度杀灭全部虫体。