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mMph3.5醋酸一步法洗脱ProA柱，先是随着PH降低形成了一个线性梯度，然后逐渐接近终点。IgG初始水动力直径是11.5nm，PH6.0洗脱直径为9.4nm,IgG的大小在峰值处继续减小，直到PH3.9时达到最大2.2nm，早期洗脱的IgG二级结构只有轻微的影响，但之后洗脱过程中2.2nmIgG中β片层和最低不规则圈状结构占所有结构中最高的比例。洗脱峰部分IgG尺寸的缩减和结构的变化归因于高浓度的IgG在低PH和导电性下减小了尺寸构像，IgG与ProA相互作用后促进IgG结构变松弛。当洗脱液接近PH3.5洗脱时，IgG的尺寸会变为10.4nm,β片层损失，α螺旋会增加，同时不规则的卷曲也会出现。之后洗脱的这些类群归因于从两个不同的结合位点ProA上洗脱下来，FC端两边各有一个键，这会使得它有更高的解离常数比单个的ProAFC端结合，就需要更恶劣的条件去洗脱，构象高度的破坏归因于两个重链与ProA相互作用。
关键词：ProA、洗脱、构象改变、IgG尺寸、IgG浓度
引言
ProA亲和层析纯化的IgG构象一直被认为是天然结构，这在最近的研究中被确认1，IgG洗脱过的ProA在生理条件下的滴定显示它的大小和二级结构与在使用ProA之前是一样的。但意外的是，抗体在洗脱过程中它的构象经过了短暂的变化，同时伴随着平均水动力直径的减小从11.5nm到5.5nm。这个结果就解释了ProA影响上部IgG二级结构不稳定的现象[2,3]，以及低PH作用下变性的作用[4–9]。
尽管这个解释看起来很吸引人，但是它还是过于简单化，没有反应出进一步的相关性，通过超速离心和X射线/中子扫描建模显示浓度与IgG大小的依赖性[10]。研究表明g/L的IgG水溶液在低PH下尺寸构象被减小[11,12]，从ProA上洗脱下来的IgG都具有在低PH和低导电性下聚集体会增多的特点。IgG的大小和浓度和洗脱条件相关，这可能导致了前期ProA研发的报道结果[1]。
我们是在更详细的水平上修正了ProA亲和层析过程中IgG的大小和构象变化，之前是针对于洗脱下来的IgG作为单一的研究对象，而我们这次是在整个洗脱峰上研究大小和二级结构。
还考虑到单独的IgG分子与ProA在柱上怎样发生作用的，IgG与ProA上主要结合位点是在FC结构域上的第二和第三疏水结构之间的间隙[2,3]。在每个重链上都有一条，这给IgG结合ProA提供了更多的可能[13],具有影响其洗脱特性的潜力，以及不同洗脱特性使得洗脱亚群暴露在不同的条件下的可能。
2材料与方法
2.1设备试剂以及实验材料配置
缓冲液，盐，和试剂均来自Sigma–Aldrich(St.Louis,MO)除了尿囊素是来自MerkMillipore(Darmstadt,Germany)ToyoprarlAF-rProA-56F是来自TosohBioscience(Tokyo).UNOsphereTMQ是来自Bio-RadLaboratories(Hercules,CA,USA).UNOsphereTMQ是来自Bio-RadLaboratories(Hercules,CA,USA).Chro-matographymedia是来自XKorTricornTMseriescolumns(GEHealthcare).Chromatographyexperiments是来自anKTATMExplorerorAvant25(GEHealthcare).采用Ho等人研发的三维模型用中国仓鼠卵巢细胞培养表达了一种具有生物相似性的IgG单克隆抗体(CHO,DG44,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)[14]，抗体是在5L玻璃搅拌发生器BIOSTATB(SartoriusStedimBiotech)采用无血清培养基，补料分批培养等量的CDCHO(LifeTechnologies)和HyQPF(GEHealthcare)，在活率在30%-50%的时候可以收获，为了防止细胞分裂的可能性避免使用泵收。通过离心过滤去除细胞，在上清液里面加加入辛酸使其浓度为0.4%，和尿囊素使其最终的浓度为1%。用1M醋酸将PH调节到5.3然后搅拌混匀2h,50mMMES预平衡UNOsphereQ,再加入ph5.mMNaCl按照总体积为5%混匀至少4h,固体通过离心和过滤的方法去除。
用于本实验的IgG是用ProA亲和层析纯化，在20ml层析介质装在XK16/20体积的柱子，线性流速为cm/h，用5CV50mMHEPS,mMNaCl,PH7.0(HBS)平衡，ml细胞培养上清加载到柱子上，并用8CVHBS洗涤后再用PH8.mMTris洗涤第二次。抗体是用ph3.5mM乙酸一步法洗脱，蛋白在UV值在nm达到50mAU的点到低于这个点收集，然后用0.1MNaOH洗涤20CV柱子.聚集体，抗体片段，DNA和宿主细胞蛋白通过阴离子交换进一步纯化去除（PH81MNaCl）1.5gIgG到ml的Captoadherecol-umn(XK26/40,linearflowratecm/h)平衡缓冲液50mMTris,1MNaCl,PH8.0,平衡缓冲液洗涤10CV,抗体用50mMMES,0.35MNaCl,pH6.0一步洗脱。
2.2实验方法
IgG在12ml(XK16/20column,6cmbedheight)柱子上纯化，线性流速cm/h，柱子平衡，洗涤，洗脱都和上面的一样，从吸光度在nm达到50mAU到低于50mAU收集了3ml样品，大多数的实验是IgG在柱子上高于承载量5%的条件下，产量可以达到25g/L.
以乙酸为缓冲液，NaOH滴定以获得最低的导电性，用于PH梯度线性起始洗脱缓冲液是20mMHEPES,20mMMES,20mM乙酸，PH7.0,最后的洗脱液20mMHEPES,20mMMES,20mMacetate,pH3.0.这种梯度缓冲液的选择是由于他们低导电性所决定的，MES和HEPES都是两性离子，不具有导电性，20mM的醋酸的浓度小于0.2mS/cm。
将层析柱装至它体积的50%后，在用PH4.4洗脱液洗脱的时候，IgG的浓度是由柱上面不同的层阶所决定的，然后IgG收集在ph3.0mM醋酸中定量。
2.3分析方法
测量IgG浓度的方法是参考了文献1。简而言之，HCP的含量是用三代CHOHCP试剂盒测试ELISA
的方法确定的.(Southport,NC)，DNA是用aQXTMDropletDigitalTMPCRSystem(Bio-RadLaboratories)确定，聚集体含量是通过G0SWxlcolumn(TosohBioscience)SEC和ionexUltiMateTM0LCsystem(ThermoScientific)分析。
溶质中自由离子的大小是用DLSZS表征(MalvernInstruments,Worcestershire,UK),ul的样品温和的混匀10S在涡旋仪后放入一个石英管(ZEN,MalvernInstruments)，使用尖底的塑料管防止有泡沫产生。用ASV-10粘度计测量溶液中-粘性物质的含量(ADCompany,Tokyo)，在°测定反向散射光，三次实验结果求平均值，衰减指数维持在7-8，使用厂家提供的7.02版本的软件处理数据。
元二色谱使用的是JASCOJ-(JASCOCorp.,Tokyo)，IgG浓度为ug/ml时使用路径为0.1cm的石英试管远紫外光谱在-nm之间，稀释剂的组成要匹配单个测试样品的PH，导电性，除了IgG,最大限度的减少对二级结构的破坏。累计32次扫描，扫描速率为nm/min,时间为0.s.所有的光谱是通过减去缓冲液的的值和32次数据的平均值。所有的实验是在常温下进行。相对不规则的卷曲、α螺旋和β片层的含量都用K2D2软件计算[15]。其他实验的细节会在接下来的章节描述或者重复。
3结果和讨论
本实验研究所用的抗体和最初报道中提到ProA洗脱中能够减小尺寸的的抗体是一样的，因为在那个实验中，实验使用的是IgG1亚型，天然水动力直径是11.5nm,宿主细胞蛋白含量小于1ppm,宿主DNA小于1ppb,聚合体小于0.1%以减小其他的干扰风险，能够证明IgG从ProA洗脱下来后和污染物之间的关系是稳定的[16]。大的污染物会在DLS造成伪影使其在同一样本中较小的物种会明显的膨胀[1,17–19]。
DLS专门确定抗体的大小是因为抗体在经过排阻层析介质的时候，因为低PH和导电性会阻止非特异性的结合[1].
3.1通过一步洗脱改变IgG大小和构象
图1：经过ProA洗脱峰IgG大小证明了IgG的异质性，抗体加载到25mg/ml时代表它柱子最大承载能力的5%。洗脱液ph3.5mM乙酸，根据ProA(pI5.0[20,21])和乙酸(pKa4.75)缓冲液的特性，在洗脱过程中PH下降曲线是符合当初的预期的，PH快速的降低是因为它替代了洗涤缓冲液，然后逐渐降低到接近终点PH值。最初IgG在PH6.0洗脱部分时水动力直径是9.4nm,大小随PH减小而减小，直到达到最小的直径2.2nm当PH降低到3.9的时候。IgG的大小随后温度升高到10.4当PH为3.5的时候。
图2：比较CD光谱和二级结构的比例，发现随着IgG的收集增多α螺旋的比例是略有增加，β片层和不规则线圈是下降的。这个结果表明天然的抗体结构是比较保守的。
对比原始抗体和2.2nm的群体显示二级结构的增加，β片层是所有构象中最多的，它从10.5%升高到16.2%，α螺旋大约上升四分之一从36.2%到49.1%，不规则线圈大约下降了四分之一，从53.4%降到34.5%，这些实验结果证明，虽然这些结构不是天然的，但仍然是稳定的中间体。
从尾部收集到的10.4nm的IgG二级结构被严重的修改，它主要的特点是降低了β片层的含量到5.7%，这表明β片层在原始的抗体中降低了一半，在2.2nm的结构中降低了2/3。相反的，α螺旋结构在占比最多56%，不规则线圈从38.4%降低到34.5%在2.2nm结构中，但是依然低于它在原始抗体分子中的52.4%，这些结果集中表明在PH3.5的时候，原始结构的损失是随着尺寸的增加造成过量的α螺旋结构伸展成轴型蛋白。
3.2线性梯度洗脱改变IgG构象
图3：相同的计量相同的IgG在同一个柱子上洗脱的PH梯度曲线图，IgG开始洗脱时的pH为4.7，而在一步洗脱的时候是6.0.IgG表观的明显不同是因为不同的PH洗脱梯度不同，考虑到一步法是直接从柱顶部立即洗脱下来，因为没有被捕获的IgG在层析中比其他的离子快速，所以IgG在未达到与配体分离条件之前出来，线性梯度洗脱会更加精确的指出IgG与配体分离的条件，因此与一步法进出口条件的区别会发现逐步的改变条件会减小进口和出口条件的差异。
IgG大小的改变和PH梯度洗脱液的变化是一致的在一步法中，IgG尺寸明显的减小是在经过主峰的时候，在尾部洗脱的时候是在增加的，这就是与一步法最大的区别。大小随着PH变化的幅度在线性梯度中小的多，但是在一步法中高很多，这两个图之间的差异表明除了PH还有一个或者多个因素的影响。之前的研究表明ProA介质的变性是因为PH的影响[1]，但这对两种洗脱方式的影响应该是相同的。
3.3IgG浓度对IgG大小的影响
图4突出显示了两种不同洗脱方式IgG浓度偏移曲线，洗脱以后再测定浓度因为在洗脱过程中在主峰的时候UV值达到饱和了对其造成干扰，IgG的浓度影响大小似乎是没有科学原理之前也没有报道，但是在其他新兴领域的研究表明，在特定环境下抗体的大小会随着抗体浓度的变化而有显著的变化。
最近的研究表明IgG1型单克隆抗体的水溶液的浓度在达到g/的时候大小会急剧减小[11,12]，较低的PH值会增加其影响，导致PH4.5的时候IgG的大小变为2nm.类似的IgG4单克隆抗体也会降低，但是开始浓度只有2.5mg/ml[10].大小和二级结构的详细描述是基于超滤和中子/X射线，研究人员认为这种影响是通过不间断的碰撞机制，这种高速的碰撞使其拥有更加紧凑的结构。
尽管它们之间的相同点是提高抗体浓度，但是IgG1和IgG4的至少在机制上是不同的，IgG4的结果显示它是不依赖NaCl的浓度[10]，IgG1的大小严重依赖于低的导电性[11,12]。之前的研究报道了ProAIgG1尺寸的减小也依赖于低的导电性[1]。NaCl的提高会使得IgG1的尺寸增加，即便IgG的浓度达到20mg/ml，它在生理配方中的大小还会保持与原来的大小。
考虑到配方研究中从ProA上洗脱条件与观察到IgG尺寸的减小相同的条件，认为这种条件对ProA增加相同的影响似乎是合理的。这似乎可以解释在两种洗脱条件下经过主峰的时候抗体大小减小的原因。这也可以解释图4中一步法和线性梯度法曲线的偏移，线性梯度法低浓度的IgG造成IgG尺寸的变小程度小于一步法较高浓度的洗脱。
这一解释的明显缺陷是2.2nm构象仅在7g/L时洗脱，这似乎低于促进IgG1尺寸减小的阈值[11,12]，但是IgG4的研究发现了一种调整这种差异的现象。IgG4具有比IgG1更加柔软的构象。即便在低浓度下，它也容易和FC结合的Fab区域配对来覆盖和阻断补体激活的位点[10]。ProA与IgG1之间的作用是发生在第二区域的上三分之处向上延伸到铰链区，同时也具有增加分子间柔韧性的作用[2,3].可能ProA与IgG的相互作用增加了柔韧性这就降低了尺寸改变的浓度阈值。
3.4在洗脱结尾时IgG尺寸的增加
IgG在洗脱结尾时的尺寸的增大是源于一种特殊的机制，这表明它的二级结构有严重的变性，但是这不能够解释为什么这些结构洗会晚一些洗脱下来。高程度的变性被认为是可以更高效的分离生物亲和力作用。这应该是是更早的洗脱而不是更晚的洗脱下来。有趣的是它自己本身的结构显示调节了这种明显的冲突。
最初与ProA结合的位点是在重链第二和第三结构域疏水区之间[2,3]。因为抗体分子是对称的，因此在每条重链上都有这样一个结合位点。这个机制会造成结合一个或者两个位点的可能性，双位点结合在ProA柱上的增加了解离困难，所以会洗脱下来的晚一些[13].这也是比较明显的结果如果抗体与衣蛾ProA分子结合，那么它会造成抗体分子构象的改变，如果与两个ProA分子结合，那么它更加会破坏抗体构象。
ProA上展示的配体促进了双位点的结合[13].通常情况下ProA就如触角一样存在经过一些商业化的固定工序它就如毛刷上面的毛一样树立在层次介质表面。单个的结合位点是柔软的，一个ProA分子上结合4-5个被不规则卷曲链接在一起的IgG.他们被牵引移动，它们与配体之间的间距是由于它们本身在生理PH条件IgG所带的负电荷之间的静电相互排斥所导致的[20,21]。
这就产生了一个这样的预期，首先进入层析柱的IgG很可能会结合两个位点，先结合一个，在结合另外一个。每一个这样的分子交叉连接在ProA配体上。之后进入的IgG就会遇到比较少的结合位点，所以就必须要与克服已被结合的这种限制再去结合。两个位点结合的频率就会随着继续加载量的增加而减少，这样会随着柱子的饱和单个位点结合的IgG会增多。
25%柱床体积的柱子加载IgG后发现在末端的洗脱峰大致对称。这些峰被认为是结合了两个位点的IgG.但是在50%DBC上面的峰明显不对称，且在前面较缓的斜坡有双峰的迹象。在%DBC有明显的双峰，早期洗脱下来单个结合位点的IgG与之后洗脱下来双个结合位点的IgG相重叠。
这些发现明显的解释了双结合位点的IgG有着更大的解离常数，应该从单个位点结合的IgG中需要两步才能洗脱下来，这个就在图6可以证明，%，50%，25%DBC结果显示。最初ph4.4可以洗脱%DBC上最大的峰，这说明是单个位点结合在柱子上的，同样的条件可以再50%DBC上洗脱下来少量的IgG,这证明在50%大多数的IgG是双位点结合的，PH4.4在25%DBC没有洗下来IgG,这说明在25%DBC上全部是双位点结合。其他剩余的IgG应该是双位点结合需要更进一步的PH3.5来洗脱。
IgG经过垂直层析柱的特性应该更深入的了解，IgG在经过加载和洗涤之后都集中在柱子顶端（如图7）。在经过ph4.4洗脱以后他们会以低浓度的形式均匀的分布在整个柱长上。这说明在ph4.4的时候单个结合位点的IgG开始从柱子上分离，但同时有些IgG会在下游的不饱和区重新结合成双结合位点，这个在25%DBC加载的时候显示（图6）最初有一些单个位点的IgG在PH4.4洗脱后被双位点重新捕获。IgG加载的越高,大多数双结合位点的IgG已经分离的时候会减小单个位点重新结合的几率，就如图6中显示的一样。
3.5.Denaturationorfacilitation?
ProA亲和层析特别是酸洗步骤，会使得抗体变性有很长的争议[2–9,13,22]。这就意外着ProA对抗体的影响是有破坏作用的，目前的结果是支持这一观点的。然而与最近其他的研究对比，ProA促进了IgG原有的构象模型。之前的研究发现ProA与酶底物之间的相互作用是相一致的[1]。与ProA结合使得构象改变被当做是一个拟合的例子。PH3.5洗脱使其构象的改变往往与更低的PH相关（不依赖ProA）被看作是ProA降低这些特定构象活化的一个例子[1]。这显然是ProA在低浓度抗体下促进抗体的大小，同时是另外一个减小构象改变所需要的活化能力的例子。（如图8）
通过在尾部洗脱条件下抗体二级结构的损伤可以直接的证明ProA对其实有损害的，但是这个影响是短暂的，在生理条件下完全可逆，甚至放在PH3.5条件下7天以后也是可逆的[1]。这似乎是公平的即便在最后的洗脱中有大量的IgG正常范围内的构象改变行为。
短暂的构象改变也只是一个潜在的问题，除了大小的改变和非二级结构出现，在洗脱条件下，ProA上洗脱下来的IgG仍然具有很高的非特异性结合性[16]，除了IgG和ProA的结合外这项技术还涉及到了很多的变量。ProA也会结合一些染色质和其他宿主污染物，IgG在洗脱过程中与污染物相互作用促进它的聚集[1,16,23,24。从ProA洗脱下来构象改变了的IgG比天然的IgG更容易集聚，在天然IgG不聚合的条件下形成更持久的聚集[1,16]。Mazzer等人[25]发现在纯化IgG4的过程中在进行低PH病毒灭火的时候IgG有不同程度的聚集。Shukla等人[26]也发表说ProA在低PH条件下会促进聚集体形成。
具体的说目前的观察对这种想象的影响有待进一步的验证，但这个有价值的结论是显而易见的：ProA作为一个研究抗体尺寸和构象变化的工具。这为更好的理解ProA层析方面提供了希望，同时可能也会为更具有价值的解决方案提供了可能。这项研究除了ProA，更重要的是让人们对IgG结构可塑性有比之前原本更多的了解。任何浓缩IgG并暴露于低PH与导电性环境中的纯化技术都可能造成影响，但是对于ProA,IgG与其配基的相互左右会更加增强这个可能。具有浓度依赖的构象改变应该是除了IgG以外其他蛋白的共同特性。
4结论
IgG1型抗体尺寸和构象的改变是与ProA配基的相互作用，IgG浓度，低的PH和导电性有关系的。IgG在洗脱最前的图谱中水动力直径是9.4nm,二级结构破坏比较小。在洗脱主峰上是直径最小达到了2.2nm，有最高的非原始二级结构出现。尺寸减小主要是由于高浓度，低PH和导电性造成了IgG直径减小的趋势。在最初的ProA和抗体相互作用的时候促进和过渡使其在合适的浓度下造成破坏。二级结构在洗脱结尾造成的破坏相应的增加了抗体的大小，这显然是由于α螺旋过度伸长所造成的水动力轴。在洗脱结尾的部分是因为抗体是两个结合位点结合在ProA上，FC端每一边结合一个它造成了更高的解离常数，要使用更恶劣的条件才能洗脱下来。这种构象高度的改变是因为两条重链同时与ProA配基相互作用的结果。
References：
[1]P.Gagnon,R.Nian,D.Leong,A.Hoi,TransientconformationalmodificationofIgGduringpurificationbyproteinAaffinitychromatography,J.Chromatogr.A()–
.[2]J.Deisenhofer,CrystallographicrefinementandatomicmodelsofahumanFcfragmentantits
